Hyvä mikrobe

Share Tweet Pin it

Koska aika Pasteur on hyvin tunnettua, että ihmisen ruoansulatuskanavassa, on olennaisesti bioreaktorissa virtauksen tyyppiä, jossa on useita mikro-organismeja elävät. Tutkijoiden suhtautuminen suolen mikroflooriin tänä aikana on muuttunut radikaalisti. Sata vuotta sitten, suuri Ilja Mechnikov, perustaja nykyaikaisen teorian immuniteetin luomiseksi, jonka hän sai Nobelin (kahdelle hänen leppymätön vastustaja, peräti suuri Paul Ehrlich), jopa ehdotti poistaminen paksusuolen keinona pidentää elämää. Ja ne, joita tämä toimenpide vaikutti liian radikaali, suositellaan juoda runsaasti jogurtti syrjäyttää haitallisia, hänen mielestään mikrobit hyödyllistä laktobasillien. Puolen vuosisadan aikana kurssi on muuttunut 180 astetta. Kävi ilmi, että normaali suoliston mikrobisto, sekä ihon ja limakalvojen, suorittaa monia hyödyllisiä toimintoja - esimerkiksi tukahduttaa elintoimintoja elimistön jatkuvasti hyökkäävät taudinaiheuttajia. Ja viime vuosina, rohkein Mikrobiologien ovat menneet pidemmälle toteamalla henkilön ja symbioottinen mikrobeja yhden superorganismi.

Kehittäminen molekyylibiologian tekniikoita on tuonut tutkijoita uudelle tasolle ymmärrystä prosessin symbioosi ihmisen ja sen mikrobisto, joka tuntui hyvin tutkittu ja tutkimuksesta, joka ei odota mitään yllätyksiä. Nopea kasvu ja lasku kustannukset menetelmät DNA-sekvenssien (määritys sen nukleotidisekvenssin) ja rinnakkaisen tehon kasvu henkilökohtaisten tietokoneiden ja Internetin kehitys oli mahdollista analysoida tietoa suuri genomin alueita. Kun kromosomi satoja yksittäisiä bakteerilajeja transkriptoitiin uuteen mikrobigenetiikan lähestymistapa - populaatio: analyysi geenien kerralla kaikki bakteerit elävät tietyn elinympäristö. Tietenkin "ihmisen bioreaktorin" väestö osoittautui olevan yksi tärkeimmistä mikrobiologisten populaatioiden tutkimiseen.

Ensimmäinen työ, joka teki uuden näkökulman suolen mikrobiota, julkaistiin vuonna 1999 tutkijaryhmä National Research Institute of Agronomic Research (Ranska) ja Reading University (Iso-Britannia). Tekijät ovat päättäneet käyttää 16S-RNA-geenien sekvensointimenetelmää mikrobien suoliston populaation tutkimiseen.

16S RNA - bakteerien tunnistaminen

Pasteurin ajasta lähtien mikro-organismien määrityksessä ensimmäinen ja välttämätön vaihe on ollut niiden viljely ravintoalustalla. Mutta monet tärkeät (ja hyödylliset ja patogeeniset) mikrobit eivät halua kasvaa mihinkään mediaan. Tutkimus aiemmin saavuttamattomissa uncultivable bakteerit ja alkaa puhdistaa täysin sekava taksonomia tunnettuja prokaryooteissa tuli mahdolliseksi kehittämisen kanssa bioinformatiikan ja tulo modernin molekyylibiologian tekniikoita - polymeraasiketjureaktio (PCR), joka mahdollistaa yhden ainoan DNA-palanen, jolloin saatiin miljardeja tarkkoja kopioita, klooni eristettiin PCR-geenejä bakteeri- plasmidit ja nukleotidisekvensointi menetelmiä, tuloksena kaikki tämä riittää ana Iza määrä.

Ihanteellinen markkeri mikro-organismien identifioimiseksi osoittautunut koodaavan geenin 16S ribosomaalisen RNA: n (kummankin ribosomaalisten alayksiköiden - työpajat solujen proteiinisynteesiä - muodostuu lomitettu ketjuja proteiinimolekyylien ja ribonukleiinihappojen).

Tämä geeni on genomissa kaikki tunnetut bakteerien ja arkkien, mutta puuttuu eukaryooteissa ja virukset, ja jos löydät hänen ominainen nukleotidisekvenssiä, - oletko varma tekemisissä geenit prokaryooteissa. (Jotta hyvin tarkka, geenin 16S RNA siellä ja eukaryooteissa, mutta ei ydinvoiman kromosomien ja mitokondrion Tämä osoittaa jälleen, että, että mitokondrioiden -. Kaukaiset jälkeläisiä symbioottisten bakteerien ensimmäisen eukaryoottisista organismeista.)

Tällä geenillä on molemmat konservatiiviset kohdat, samoin kaikille prokaryooteille ja lajikohtaisesti. Yksinkertainen käyrät ovat tämän ensimmäisen vaiheen polymeraasiketjureaktion - lisäämällä kohde-DNA: ta alukkeiden (siemen DNA-osien, joihin tutkittu nukleotidiketjun pitäisi liittyä aloittaa analysoimalla muun sekvenssin) ja lajikohtaisten - lajien tunnistamiseen. Lisäksi lajikohtaisten kohteiden samankaltaisuusaste heijastaa hyvin eri lajien evoluutiosuhdetta.

Lisäsuoritus - kloonauksen ja sen jälkeisen analyysin avulla voit käyttää itse ribosomaalista RNA: ta, joka jokaisessa solussa on paljon suurempi määrä kuin vastaava geeni. Vain meidän on ensin kirjoitettava DNA uudelleen käyttämällä erityistä entsyymiä - käänteistranskriptaasia.

Yleisesti saatavilla ovat kaikkien tunnettujen bakteerien ja archaean (noin 10 000 lajia) 16S-RNA: n nukleotidisekvenssit. Tunnistettuja sekvenssejä verrataan tietokantoihin löytyneisiin ja täsmennetään tarkasti bakteerilajit tai ilmoittavat sen kuuluvan seuraaviin viljelemättömiin lajeihin.

Viime aikoina on intensiivinen tarkastelu vanhan, fenotyyppinen luokittelu bakteerien perustuu huonosti asettaneet perusteita - ulkonäköä pesäkkeet ruokamieltymykset ja kyky maalataan eri väreillä. Uusi järjestelmä perustuu molekyylikriteereihin (16S RNA) ja vain osittain toistaa fenotyyppisen.

Koodaussekvenssit 16S RNA PCR otettiin talteen suoraan "ympäristö" - 125 mg ihmisen, anteeksi, uloste, insertoitiin plasmidiin E. coli (ei, koska se suolen, ja koska Escherichia coli - yksi suosikki työjuhta molekyylibiologit ) ja eristetty uudelleen monistettujen bakteerien viljelmästä. Siten luotiin 16S RNA -geenien kirjasto kaikille näytteen mikro-organismeille. Tämän jälkeen 284 kloonia valittiin satunnaisesti ja sekvensoitiin. Kävi ilmi, että vain 24% tuloksena olevista 16S-RNA-sekvensseistä kuului aikaisemmin tunnetuille mikro-organismeille. Kolme neljäsosaa mikroflooran sijaitsee suolistossa jokaisen ihmisen, yli sata vuotta välttänyt huomiota tutkijoiden, aseistettu menetelmiä klassisen mikrobiologian! Tutkijat yksinkertaisesti ei löytänyt ehtoja viljelemiseen näille bakteereille, koska kaikkein oikukas asukkaat suolen kieltäytyi nousta perinteisen mikrobien ympäristöissä.

Tähän mennessä on käytetty molekyylien menetelmien mukaan 10: sta 70: stä suuresta bakteeriperäisestä taksosta aikuisen mikrobiotissa. Noin 90% mikrobeista kuuluvat firmicutes tyyppi (tämä sisältää esimerkiksi kuuluisa maitohappobakteerit - tärkein "syyllisiä" souring maito) ja Bacteroidetes - velvoittaa anaerobeja (organismeja, jotka voivat elää vain ilman happea), joita usein käytetään indikaattorina saasteiden luonnonveden jätevedet. Loput 10% väestöstä jaettu taksonikoostumus proteobakteerien (näitä ovat muun muassa E. coli), Actinobacteria (yhdestä aktinomykeettilajia antibiootti streptomysiiniä eristettiin), Fusobacteria (normaali asukasta suuontelon ja aiheuttavat usein parodontiitti), Verrucomicrobia (äskettäin geoterminen lähde havaittiin muodossa mikrobeja, jotka syövät metaania, joka on runsaasti suolistossa, koska muita mikro-organismeja), syanobakteerit (ne ovat edelleen usein kutsutaan vanha nimi "sinilevien»), Spirochaeates (Odota Tew, ei kalpea), Synergistes ja VadinBE97 (millaisia ​​eläimiä, pyydä luovat uuden taksonomian prokaryootit).

Huolimatta siitä, että suolen mikro-organismien lajikoostumus on melko monotoninen, tiettyjen systemaattisten ryhmien edustajien määrällinen suhde eri ihmisten mikrobiotissa voi vaihdella suuresti. Mutta mikä on normaali suolen mikrofluora ja mitkä ovat sen muodostumiskeinot?

Tämä kysymys vastasi vuoden 2007 työhön amerikkalaisten biologien ryhmästä, jota johti Patrick Brown Stanfordin yliopistosta. Ne jäljittivät mikrobiotteen muodostumista 14 vastasyntyneelle ensimmäisen elinvuoden aikana. Kirjoittajat onnistuivat luomaan useita lähteitä ruoansulatuskanavan kolonisaatiosta. Vauvojen mikrobiotit olivat samanlaisia ​​kuin äidin mikrofloora: emättimen, ulosteiden tai mikrofloranäytteet rintamaidosta. Riippuen lähteistä siirtokuntien suoliston mikrobisto imeväisten ensimmäisen elinvuoden hallitsi eri lajia. Nämä erot pysyivät merkittävinä koko tutkimusjakson ajan, mutta vuoden ikäisenä näkyi aikuisen mikrobiotin muodostumisen piirteet. Mielenkiintoisia tietoja saatiin käyttämällä kaksoisparia. Niiden mikrofloora oli koostumukseltaan käytännöllisesti katsoen identtinen ja vaihteli samalla tavalla. Tämä havainto paljasti vastaanottavan mikrobiotaparin ihmisen komponentin valtavan roolin suolen mikrofloora-populaation muodostumisessa. Kokeilun puhtauden vuoksi tietenkin pitäisi erottaa vauvat takaisin sairaalaan - suuri tarina Intian elokuville! Vuosien mittaan he tuntevat toisensa... Mutta analysoitaessa muiden tutkimusten tiedot vahvistivat oletukseen, että yksittäiset, mukaan lukien perinnöllinen, ihmisen biokemia ominaisuuksilla on suuri vaikutus kokoonpanosta mikrobiston.

Mikrobia meissä enemmän kuin ihminen

Lisäksi tutkimuksessa tietyntyyppisten suoliston mikrobisto, viime vuosina monet tutkijat tutkivat bakteerien metagenom - joukko geenejä kaikkien organismien näyte sisällöstä ihmisen suolessa (tai ihon punoitus, tai mutaa näytteessä merenpohjasta). Tätä tarkoitusta varten, kaikkein automatisoitu, tietokoneistettu ja korkean suorituskyvyn DNA-sekvensoinnin tekniikoita, jotka mahdollistavat analysoida lyhyitä nukleotidisekvenssejä, kerätä palapeli useita päällekkäisiä "kirjaimet" päissä näiden osien, useita toista tämä menettely jokaisen palan genomin ja vastaanottaa dekoodaus yksittäisten geenien ja kromosomien nopeudella jopa 14 miljoonaa nukleotidia tunnissa - suuruusluokkia nopeammin kuin vain muutama vuosi sitten. Näin todettiin, että ihmisen suoliston mikrobiston on noin 100 bakteerisolut trillionov - noin 10 kertaa enemmän kuin kokonaismäärä päällikön kehon soluihin. Bakteerien metagenomiin muodostavien geenien joukko on noin 100 kertaa suurempi kuin ihmiskehon geenien joukko. Jos puhumme mikrobipopulaatiossa esiintyvien biokemiallisten reaktioiden määrästä, se ylittää yhä uudestaan ​​ihmisen kehossa. Bakteerien "reaktori" suorittaa vastaanottavassa aineenvaihdunnan ketju, joka, joka ei kykene tukemaan itseään - esimerkiksi synteesi vitamiinien ja niiden esiasteita, hajoaminen noin toksiinien, hajoaminen selluloosan sulavat polysakkaridit (märehtijöissä), jne.

Tutkimuksissa laboratoriossa Jeffrey Gordon (School of Medicine Washington Universityssä, St. Louis, MO) sidotaan lajin bakteerien monimuotoisuutta ruoansulatuskanavan ruokavalion ja yksilön ominaisuuksista aineenvaihduntaa. Kokeilun tulokset julkaistiin joulukuussa joulukuussa 2006. Vuosikokeessa ehdotettiin ihmisen ylimäärän ja hänen suolistansa mikrobipopulaation koostumuksen välisen korrelaation määrittämistä. Kymmeniä rasvoja, jotka suostuivat asettamaan kynnet tieteen alttarille, jaettiin kahteen ryhmään. Yksi kylä ruokavaliolla vähärasvainen, toinen - matala hiilihydraattipitoisuus. Kaikki vapaaehtoiset menetetty paino, ja samalla ne ovat muuttuneet suhde kaksi pääryhmää suoliston mikro-organismien: solujen lukumäärä on firmicutes väheni, kun taas määrä Bacteroidetes, päinvastoin, lisääntynyt. On vähärasvainen ruokavalio tällaisia ​​muutoksia tuli näkyvästi myöhemmin - sen jälkeen, kun potilaat olivat menettäneet 6% painosta, ja Vähähiilihydraattinen - hävittyään ensimmäisen kiloa (2%: n alkupaino). Muutos koostumuksessa mikroflooran oli selvempi pienemmän kertoimen tuli osallistujat kokeiluun.

Samanaikaisesti samassa laboratoriossa tehtiin kokeita laboratoriossa hiirillä, joilla on mutaatio geenissä leptiinin - "kylläisyyden hormoni" proteiini, joka on syntetisoitu rasvakudoksessa soluissa, ja laittaa panoksen muodostumisen kylläisyyden. Hiiret, joiden molempien kopioiden vaurioituneen geenin (tämä mutaatio on merkitty indeksillä, Lep ob), syödä 70% enemmän kuin villityypin, jossa kaikki seurauksensa. Sisällön firmicutes niiden suolet ja puoli kertaa suurempi kuin heterotsygoottinen linjat, jossa on vain yksi viallinen alleeli (ob / +) ja homotsygoottisia normaalin geenin villityypin kantoja (+ / +).

Mikroflora vaikuttaa sen "isäntän" aineenvaihduntaan toisella mallilla testatuilla tutkijoilla - gnotobiotiikilla hiirillä.

Tällaiset eläimet syntymästä asuu steriili kammioissa, eikä koskaan elämässäni tavannut yhtään mikrobia käytetään biolääketieteen tutkimus ei ole usein. Absoluuttinen steriiliyden myshatnike, Rabbitry ja varsinkin vuohi lato - kallis ja hankala, ja tapaamisen jälkeen ensimmäisen mikrobin tai viruksen tai huono kuolee tai tulee sopimaton lisäkokeita. Mitä tapahtuu gnotobiote kanssa immuunijärjestelmä - on toinen tarina, ja he syövät kolme ja samalla - luuta ja nahkaa puutteen vuoksi mikrobien ruoansulatusta komponentti.

Sen jälkeen, kun mikrofloora oli siirretty lihavilta (ob / ob) luovuttajilta, gnotobiotii- set hiiret olivat lähes 50% lihotettuna kahden viikon ajan (47%). Ne, jotka kylvettiin mikrofloorilla villityypin (+ / +) luovuttajilta, joilla oli normaali paino, palautuivat vain 27%.

Symbioottisen hiiren mikrobien organismin muutosten lisätutkimusten tulokset vahvistivat loogisesti hypoteesin, jonka mukaan liikalihavalmisteiden mikrobiot osallistuvat syvempään elintarvikkeiden käsittelyyn. Lihavien ja normaalien hiirien ulosteiden DNA-näytteiden vertailu osoitti, että lihavien hiirien hiiret kyllästyvät entsyymigeeneillä, jotka sallivat polysakkaridien tehokkaamman hajoamisen. Lihavien hiirten suolessa oli suuria määriä lopullisia käymistuotteita - etikkahappoja ja voihappoyhdisteitä, mikä viittasi elintarvikekomponenttien syvempään käsittelyyn. Kalorimetrinen analyysi (sanasta "kalorit"!) Stoolinäytteiden analyysi vahvisti tämän: ob / ob-hiirten tuoli sisälsi vähemmän kaloreita kuin villityypin hiiret, jotka eivät täysin absorboineet energiaa elintarvikkeesta.

Sen lisäksi, että tärkeitä tietoja "alkio" osa lihavuuden, kirjoittajat pystyivät osoittamaan perustavanlaatuisia samankaltaisuus mikrobikasvustoon lihavia ihmisillä ja hiirillä, mikä avaa uusia näkökulmia ongelman tutkimukset ylipainoa, ja ehkä - ja ratkaisemaan tämän ongelman "siirto" terve mikrobisto tai sen muodostumista potilailla, kärsivät liikalihavuudesta.

Mikrobiotin hallitseminen isännän aineenvaihdunnassa ei enää ole epäilystäkään. Tutkimukset Gordon laboratorio omistettu ongelma ylipainoa mahdollisti kuilun kohtelusta aineenvaihdunnan sairauksiin, kuten kakeksia, vaikuttaa lapsiin yhdestä vuodesta neljään vuoteen köyhissä trooppisissa maissa - marazmus (ja typeryys, että sanalla on vain kielellisesti: Greek marasmos. kirjaimellisesti tarkoittaa ehtyminen, sukupuuttoon) ja kvašiorkor (kielellä yksi heimojen Ghanan kvašiorkor - "punainen poika"). Sellaisten tautien esiintyminen liittyy puute proteiineja ja vitamiineja siirryttäessä imetyksen aikuisten ruokaa. Mutta tauti valikoivasti vaikuttaa lapsiin, joiden sisarukset eivät ole kokenut mitään ongelmia siirtymisen perinteisen ruokavaliossa tällä alueella. Tutkimukset ovat osoittaneet, että suoliston mikrofloora sairaiden lasten on hyvin erilainen kuin mikrofloorasta vanhempiensa, samoin kuin mikrobisto terveiden sisarusten. Ennen kaikkea on huomattava lähes täydellinen puuttuminen suoliston populaatioiden Bacteroidetes ja ylivaltaa harvinaisten lajien kuuluvien tyypit proteobakteerien ja Fusobacteria. Jälkeen sairaita lapsia (varo yliannostuksen!) Lihotetaan kovan proteiini ruokaa, niiden mikrobisto muuttuu lähellä normaalia, kuten sukulaisia, joista suurin osa on Bacteroidetes ja firmicutes.

Viime vuosina tehdyt tutkimukset eivät ainoastaan ​​muuttaneet radikaalisti vallitsevia käsityksiä ihmisen suolen mikrofloorasta, vaan myös vaikuttaneet sellaisen käsitteen syntyyn, joka pitää suolen mikrobiota ihmisen kehon ylimääräisenä monisoluisena "urana". Eri solulinjoista koostuva elin, joka kykenee kommunikoimaan keskenään samoin kuin isäntäorganismin kanssa. Elimistö, joka jakaa energiavirtoja, toteuttaa tärkeitä fysiologisia reaktioita, muuttaa ympäristön vaikutuksia ja palauttaa itsensä takaisin ulkoisten olosuhteiden aiheuttamilla muutoksilla.

Jatkuvan tutkimuksen "bakteeri elin" voi ja sen pitäisi johtaa ymmärrystä lakeja sen toimintaa, paljastaminen hänen herkkä suhteita isännän ja tämän seurauksena, uusien menetelmien torjumiseksi ihmisen sairauksien kohdennetulla dysfunktioiden molempien metaorganizma komponentteja.

Valery Poroiko, Ph.D.
University of Chicago, Yleisleikkauksen laitos
Portal «Eternal Youth» www.vechnayamolodost.ru

Lehden versio julkaistaan ​​julkaisussa "Popular Mechanics" nro 4-2008

Bakteerien spesifinen tunnistaminen ribosomaalisen RNA: n 16S-geenin sekvensointimenetelmällä, menetelmän rooli ja paikka bakteeri-infektioiden diagnoosissa Valmistettiin: Savelyeva. - esitys

Esitys julkaistiin 4 vuotta sitten byLюдмила Шумихина

Liittyvät esitykset

11. luokan esittely aiheesta: "Bakteerien spesifinen tunnistaminen ribosomaalisen RNA: n 16S-geenin sekvensointimenetelmällä, menetelmän rooli ja paikka bakteeri-infektioiden diagnoosissa. Lataa ilmaiseksi ja ilman rekisteröitymistä. - transkripti:

1 lajin bakteerien tunnistamiseen sekvensoimalla 16S geenin ribosomaalisen RNA: rooli ja paikka menetelmän diagnoosi bakteeri-infektioiden täyttyvät: Savelieva Xenia täyttyvät: Savelieva Xenia, oppilas 11 erikoistunut luokan oppilas 11 erikoistunut luokan MBOU Krasnoobsk SOSH 1 MBOU Krasnoobsk SOSH 1 ohjaaja: Ohjaaja : Cand. Biol. Tiedekunnat Afonyushkin Vasily Nikolaevich Cand. Biol. Tiedekunnat Afonyushkin Vasily Nikolaevich

2 Tavoitteet: 1. hallita DNA-elektroforeesilla agaroosigeelissä 2. oppia analysoitaessa sekvensointitulokset, ja suorittaa rakentaminen nukleotidisekvenssien, geenifragmentit 16 S ribosomaalisen RNA: saatujen isolaattien master Bacillus-suvun 1. DNA-elektroforeesilla agaroosigeelissä 2. oppia analysoimiseksi sekvensointitulosten ja suorittaa rakentaminen nukleotidisekvenssien, geenifragmentit 16 S ribosomaalisen RNA: saatujen isolaattien Bacillus-suvun 3. Tutkitaan näkökulmasta jakaa sekvensointimenetelmillä ja biokemia cal bakteerien tunnistamiseen 3. tutkimiseksi näkymiä jakaa sekvensointimenetelmät, ja biokemialliset bakteerien tunnistamiseen Tarkoitus: tutkimaan mahdollisuuksia menetelmän erityinen tunnistamiseksi bakteerien 16S ribosomaalisen RNA: n yhdessä perinteisten menetelmien tunnistamista

3 Materiaalit ja menetelmät -puhdasviljelmiä isolaattien maljattiin MPA tuntia ja inkuboinnin jälkeen bakteerisuspensiota valmistettiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Viljelmät värjättiin grammalla ja mikroskooppisella. Arvioitiin seuraavat biokemialliset ominaisuudet: Jätteiden sitraatti, malonaatti, glukoosi, laktoosi, mannitoli, sakkaroosi, inositoli, sorbitoli, arabinoosi, maltoosi, fenyylialaniini, muodostumista indoli, rikkivetyä, atsetilmetilkarabinola (reaktio Foges- Proskauer), läsnä ollessa beeta-galaktosidaasi, ureaasi, arginiinidekarboksylaasi ja lysiini, arginiinin hydrolaasit. Viljelmiä testattiin katalaasia, sytokromioksidaasi aktiivisuus, muodostumista nitriittien, pigmentti synteesi, antibioottiresistenssi, ja tutki kulttuurin ja morfologiset ominaisuudet. Beeta-galaktosidaasi, ja tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktiivisuus testattiin keskipitkän Uriselekt 4 (BioRad) DNA eristettiin fenolhloroformennym näkymä määritetään perustuen 16S ribosomaalisen geenin RNAi fragmentin intergeeninen välikkeen ribosomaalisen RNA: n ja 16-23S useita biokemiallisia, kulttuurin ja morfologiset ominaisuudet.

4 Kulttuuriominaisuudet: kasvatetut kulttuurit eivät kasvaneet Endo-ympäristössä; ei koskenut enterobakteerit, kasvatettu liha-peptoni-agarilla aerobisissa olosuhteissa 37 ° C: ssa hatuksen ominaisuudet: kasvatettuna tutkittiin mikroskooppisesti ja gram-värjäys, joka saa todeta, että saadun viljelmän ovat itiöitä Gy + tikkuja ominaisuudet Cultures

Tutkimusmenetelmä: DNA kasvatettiin kasvatetuista viljelmistä ja PCR: tä levitettiin universaalisilla alukkeilla, minkä seurauksena monistimme ribosomaalisen RNA: n 16S-geenin fragmentin

6 alukkeen kanssa, joka liuos jaettiin 4 koeputkiin, joista kukin on neljä deoksinukleotiditrifos- dATP, dCTP, dTTP (yksi radioktivnym isotooppi-leimattu) ja yksi neljästä 2, 3- dideoksinukleotidien (ddATR, ddTTR, ddGTP, dd MFR) dideoksinukleotidisekven- se sisältyy kaikissa asennoissa kasvavien ketjujen seoksen, ja liityttyään ketjun kasvu pysähtyy välittömästi. Seurauksena, jokaisessa neljä putkea, johon osallistuvat DNA-polymeraasi tuotti ainutlaatuisen olignukleotidov eri pituisia, joka käsittää praymerovuyu sekvenssin. Edelleen, putket lisättiin formalid eroja ketjuja ja elektroforeesi geelillä polyakryylihapon cheteryh kappaleita. Viettää autoradiografialla, joka tekee mahdolliseksi "lukea" sekvensointi nukleiinihapposekvenssi DNA-segmentin. Biokemian ja molekyylibiologian elektroforeesia käytetään erottamaan makromolekyyliseen proteiinien ja nukleiinihappojen (ja niiden fragmentit). Tällä menetelmällä on monia lajikkeita. Tämä menetelmä havaitsee leveä hakemuksen seosten erottaminen biomolekyylien jakeisiin tai yksittäisten aineiden ja sitä käytetään biokemian, molekyylibiologian, kliinisessä diagnostiikassa, populaatiobiologia (tutkittaessa geneettistä vaihtelua) ja dr.belkovnukleinovyh hapot elektroforeesi tämä sähkökineettinen ilmiö siirtymä dispergoidun faasin (kolloidi tai proteiini liuos) nestemäisen tai kaasumaisen väliaineen vaikutuksesta ulkoisen sähkö- polya.elektrokineticheskoe yavlenieelektricheskogo polyaElektroforez Järjestelmä tutkimukset: PCR-tuotteet erotettiin elektroforeesilla agaroosigeelillä. Sangerin menetelmä

7 Omien tutkimustulosten kuva 1 Tulokset ribosomisen RNA: n 16S-geenin kapillaarisen elektroforeesin tuloksista

8 Kuv. 2 filogeneettinen puu, joka on rakennettu ribosomaalisen RNA: n 16S-geenin fragmentin linjauksen tulosten perusteella

9 Oman tutkimuksen tulokset 3 Nukleotidisekvenssien vertailun tulokset

10 tulokset biokemiallisten tutkimusten viljelmistä käyttäen testiä PBDE Biochemical ominaisuudet kannan B. licheniformis: negatiivinen käyttö sitraatti, malonaatti negatiivinen, natriumsitraatti + glukoosin negatiivinen negatiivinen lysiini, arginiini negatiivinen, negatiivinen ornitiini, fenyylialaniini negatiivinen, indoli negatiivinen, ureaasi positiivinen atsetilmetilkarabinol negatiivisesti sulfidi negatiivinen, positiivinen, glukoosi, b-galaktosidaasi positiivinen, negatiivinen laktoosi, mannitoli positiivinen, positiivinen sakkaroosia, inositolia positiivisesti Sorbitolin positiivinen, maltoosi positiivinen

11 Johtopäätös lajien mikro-organismien identifioimiseksi perusteella sekvensointi voi olla "kultainen standardi" laboratoriodiagnoosia, mutta menetelmän tarkkuus on rajoitettu luotettavuutta ja kattavuutta tietokannan GenBank ja näin ollen edellyttää ylimääräisiä varmistustestejä.

16S-RNA: n analyysi

Biotechnology, 2005, № 6, 3-11

Menetelmä tunnistaa mikro-organismit, jotka perustuvat analyysiin restriktiofragmentin (RFLP), PCR-tuote geenin RNA 16S pituus 1500 nukleotidia. 6 täsmäsi joukko restriktioendonukleaaseilla (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ja Rsal), käyttäen RFLP voidaan tunnistaa monenlaisia ​​mikro-organismeja.
Luonnollisista meriveden isolaateista eristettiin neljä isolaattia, jotka olivat termolabileita alkalinen fosfataasi. Näiden kantojen PFR-analyysi verrattuna erilaisten mikro-organismien 16S-RNA-geenien laskettuihin tuloksiin mahdollisti sen, että tunnistetut tuottajat kuuluvat Alteromonas-sukuun.

Sekä perinteisiin mikro-organismien identifioimiseksi käyttäen kulttuurin ja morfologiset ominaisuudet, sekä kemialliset ja biokemialliset reaktiot [1], on viime aikoina yhä enemmän käytetään laajasti menetelmistä mikro-organismien perustuvat vertailuun nukleotidisekvenssien geenien erilaisia ​​mikro-organismeja [2-4] ja pituus polymorfismianalyysiä DNA-restriktiofragmenttien saatu monistamalla erityisiä bakteeri- geenien [5,6]. Useimmat ovat sopivia identifioimaan geenejä, jotka koodaavat 16S ja 23S ribosomaalisen RNA: t, koska ne ovat läsnä kaikissa bakteerisoluissa ovat sukuspesifistä ja useimmat mikro-organismit [7-9]. Käyttää tunnistamaan DNA-fragmentti, joka sisältää molemmat geenit 16S ja 23S RNA: n, ja välikappale niiden välissä ja ovat muuttuvia, mahdollistaa erottamaan läheistä sukua olevien lajien ja alalaji mikro-organismien [10].

Tässä asiakirjassa esitetään tuloksia RFLP-analyysi PCR-tuotteen 1500 nukleotidiä eri mikro-organismien ja osoittanut, että käytön restriktioendonukleaaseilla 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI RsaI ja voi luotettavasti tunnistaa useimmat mikro-organismit. Paperin tunnistettu 4 uutta tuottaja lämpölabiileja alkalisen fosfataasin ja ehdotettu menetelmä, vertaileva analyysi RFLP tunnistamiseksi näiden mikro-organismien. Vertailujen perusteella todetaan, että tulokset tuottajat kuuluvat sukuun Alteromonas.

Kokeelliset olosuhteet

Havaitsemiseksi tuottaa termolabiilia alkalinen fosfataasi 50 l meriveden trituroitiin ravinneagarissa pinnalle ja analysoitiin, kuten on kuvattu [11]. Valmistamiseksi mikrobibiomassan suoritettiin kasvattamalla tuottaa 20 ° C: ssa liemessä, joka sisälsi 1% tryptonia (AGS GmbH, Saksa), 0,5% hiivauutetta (sama yhtiö) ja merisuola vettä (NaCI - 27,5, MgCI2 - 5, MgSO4 - 2, CaCl2 - 0,5, KCl - 1, FeS04 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. Siemenliemi jaettiin 200 ml: sta 700 ml: n mittapulloihin ja ravisteltiin 150 rpm: llä 16 tunnin ajan.

Kromosomisen DNA: n eristäminen suoritettiin [13]: n menetelmällä.

Ribosomaalisen RNA: n 16S-geenin amplifiointi suoritettiin polymeraasiketjureaktiolla [14] kuvatulla tavalla.

Monistetun DNA: n restriktio- reaktio suoritettiin 4 tuntia 37 ° C: ssa 20 pl: ssa reaktioseosta, joka sisälsi 2 ekv. teko. SibEnzyme-kansalaisjärjestön restriktioentsyymit Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI tai RsaI, vastaavassa puskurissa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 5 ui pysäytysliuosta, joka sisälsi 0,1 M EDTA: ta, 0,05% bromifenolisinistä ja 40% sakkaroosia.

Elektroforeettinen erottaminen rajoitus tuotteiden monistetun DNA suoritettiin 2% agaroosia (Sigma) Tris-asetaattipuskurissa, jossa etidiumbromidilla (0,5 mg / l), 120 V: ssa 4 tuntia.

DNA-molekyylipainomerkkiaineita (100 bp + 1,5 kb DNA-merkkiaineita, "SibEnzim" -organisaatiota) käytettiin DNA-fragmenttien pituuden määrittämiseen. Saadun rajoituksen pituus määritettiin käyttäen tietokoneohjelman Gel Pro Analyzer, versiota 4.0.00.001. Fragmenttien pituuden prosentuaalinen identtisyys laskettiin jokaiselle mikro-organismipariin vertailemalla rajoituskuviota erikseen jokaiselle restriktioentsyymille. Vertailua rajoittavan pituuden arvioitiin olevan pituudeltaan samanlaisia ​​DNA-fragmentteja enintään 5%.

Vertaamaan kokeellisia tietoja 16S RNA -geenien julkaistujen sekvenssien kanssa käytettiin geneettistä tietokantaa sekvensseistä sekvensseistä.

TULOKSET JA KESKUSTELU

Neljä isolaatteja luonnon tuottajalta kannan termolabiilia fosfataasin eristettiin kosketuksiin meriveden, merkitty 20, 27, 48 ja kanta tunnettu aiemmin [11] käyttäen tavanomaisia ​​tekniikoita, kuten Alteromonas undina. Nestemäisen ravintoalustan kasvattamien mikro-organismien biomassasta saadut kannat tunnistettiin lisäämällä merisuoloja, eristettiin kromosomaalinen DNA.
Seuraava, kromosomaalista DNA: ta käytettiin polymeraasiketjureaktiota monistamaan 16S ribosomaalisen RNA: n geenin. Monistustuotteen käsiteltiin itsenäisesti 6 eri restriktioendonukleaaseilla. Kaikki olemme käyttäneet tetranucleotide restriktioendonukleaasitunnistuskohtaa, jonka avulla voidaan saada 3-8 DNA-fragmenttien, jotka saatiin pilkkomalla monistustuotteen, jonka pituus on noin 1500 bp. Restriktioentsyymillä ja käytetyt Sse9I Tru9I ovat vastaavasti AATT tunnistuskohdat ja TTAA taas BsuRI ja MspI restriktioentsyymillä leikata sivustoja GGCC ja CCGG. Restriktioentsyymitunnistuskohtia BstMBI ja Rsal, vastaavasti GATC ja GTAC, sisältää sen koostumus kaikkien neljän nukleotidin. Tällainen valinta restriktioendonukleaaseja on, meidän mielestämme, tarjoavat joustavuutta mikro-organismien identifioimiseksi, joilla on sekä AT- rikkaita tai GC-rikas genomeja. Määrällisesti käyttö vain kuusi erilaista rajoitusta uskomme optimaalinen, koska käyttö restriktioendonukleaaseilla 1 tai 3, kuten on ehdotettu useissa tutkimuksissa [10,15] ei voi havaita polymorfismeja, jolla tunnistetaan läheistä sukua olevien organismien tai vaihtoehtoisesti aiheuttaa liian suuria eroja iz yhdelle tai useammalle satunnaisia ​​mutaatioita. Kuitenkin käyttää 10 eri restriktioendonukleaaseilla ei aiheuta ylimääräistä pituus polymorfismi havaitsemiseksi DNA-restriktiofragmenttien on selvästi tarpeeton [9].
Kuvio 1 esittää simuloitu tietokoneella kuva rajoitus genov16S RNA, olemme ehdottaneet joukon kuuden restriktioentsyymeillä (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ja RsaI). 16S-RNA: n geenit otetaan sekvensoidun sekvenssin geneettiseen pankkiin. Mikroorganismien valinta oli varsin satunnaista. Kaikki bakteerit kuuluvat eri sukuihin ja edustavat sekä gram-negatiivisia että grampositiivisia mikro-organismeja. Voidaan nähdä, että kaikilla mikro-organismeilla on rajoittava entsyymiryhmä. DNA-fragmenttien määrä vaihtelee 23: stä 30: een (fragmenttien pituus, joka on alle 100 paria nukleotidejä, ei oteta huomioon). Tulokset laskettaessa identtisyysprosentti pituuksien DNA-fragmenttien (restriktiofragmentti pidetään pituudeltaan identtiset poikkea enempää kuin 5%) eri parien mikro-organismien esitetään taulukossa 1. Tässä taulukossa on esitetty vain pareina mikro-organismien kuviossa. 1. Esitetyt vertailutulokset ovat kuitenkin melko tyypillisiä ja ne antavat mahdollisuuden nähdä, että DNA-fragmentin pituuden prosentuaalinen identtisyys vaihtelee tavallisesti 12-28 prosentilla eri mikrobien sukupuolten edustajille. Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että restriktiokuvion geenien 16S RNA: n ehdotettu kosketukseen joukko restriktioentsyymeillä voivat toimia perustana määriteltäessä geneerisiä tarvikkeet bakteerisolut.

Kuva 1. Teoreettisesti laskettu kuvio elektroforeettinen erottaminen 16S RNA: n geenin monistumisen käsittelyn jälkeen restriktioentsyymeillä Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) ja RsaI (6). Rivit M - molekyylipainomarkkeri

16S-RNA: n arvo taksonomissa. 16S-RNA: n molekyylihybridisaatio.

16S rRNA: n molekyylihybridisaatio. Prokaryoottinen ribosomi koostuu kolmesta alayksiköstä, suurista (23S), (5S) ja (16S). Gene 16S rRNA: lla on seuraavat ominaisuudet, jotka ovat tärkeitä filogeenissä:

1. RNA Ribosomit ovat yleisempää eri lajeille, kuten itse ribosomit. 2. Molekyyli 16S rRNA on konservatiivinen ja pienin muutos biologisen evoluution aikana. 16S-rRNA-geenin muutosnopeus eri symbioottisissa bakteereissa oli 2-4% nukleotidisubstituutiosta 60 my: n sisällä.3. Gene 16S rRNA: lla on sekä ultrakonservatiivisia että vaihtelevia domeeneja (domeeneja), mikä mahdollistaa etäisten ja läheisten suhteiden arvioinnin.4. Lisäksi Lisäksi havaittiin, että rRNA-kystronit eivät osallistu lajienvälisen geneettisen siirron prosesseihin.5. Koko (prokaryootteissa se on noin 1550-1640 bp pitkä) on optimaalinen tilastevirheiden vähentämiseksi. Koko sekvenssi voidaan määrittää yhdellä sekvensoinnilla Sanger-menetelmällä.Nukleotidiluetteloiden vertailu. Menetelmää käytettiin 80-luvun alussa ja sillä oli suuri historiallinen merkitys bakteerien järjestämisessä. Tässä tapauksessa RNA-molekyyliä (16S rRNA) käsiteltiin ribonukleaasilla T, joka katkaisee molekyylin guaniinin jäämien yli. Saatujen fragmenttien koko oli korkeintaan 20 nukleotidia. Saadut oligonukleotidit erotettiin 2-meerisellä elektroforeesilla, sekvensoitiin ja muodostettiin luettelo, joka spesifisesti rRNA-molekyyliä luonnehtii. Vertailemalla luetteloita otettiin huomioon vähintään 6 nukleotidin pituiset fragmentit. Sovellettaessa kuvioiden välisiä samankaltaisuuksia kerättiin ensin prokaryooteille yleinen filogeeninen puu. Riboprinting. Menetelmä perustuu rRNA-geenien restriktioanalyysiin. Voit tehdä tämän eristämällä kokonaisen DNA: n solusta. Kaksi aluketta, jotka ovat homologisia geenin 16S rRNA: n (pienen alayksikkö-ss rDNA: n) erittäin konservoituneiden reunusalueiden kanssa, otetaan ja PCR suoritetaan. Fragmenteja käsitellään useilla restriktioendonukleaaseilla, ja kunkin endonukleaasin restriktiotuotteet erotetaan agaroosigeelissä yhdessä DNA: n kokoprofiilin kanssa. Fragmenttipituuksien polymorfismi johtuu siitä, että jotkut restriktiokohteista kuuluvat geenin konservatiivisiin domeeneihin ja joihinkin - vaihtelevaan domeeniin. Samaan aikaan jotkin fragmentit ovat yhteisiä kaikille näytteen lajille. Yhteisten ja eri fragmenttien lukumäärän perusteella on mahdollista laskea lajien välinen geneettinen etäisyys. 12-restriktioentsyymien käyttö tunnistussivustoilla, joissa on 4 nukleotidia pitkä, mahdollistaa 10-15% 16S rRNA -geenipituudesta analysoimalla turvautumatta sekvensointiin.

Hyvä mikrobe

Valery Poroiko,
Ph.D., Chicagon yliopisto, Yleisleikkauksen laitos
Popular Mechanics №4, 2008

Vain sata vuotta sitten ihmisten suolistossa eläviä mikrobeja pidettiin freeloadereina ja tuholaisina. Viime vuosina ihmisen mikrobiota on kutsuttu eräänlaiseksi kehon elimeksi, joka tarvitaan kehon tavanomaiseen elämään.

Koska aika Pasteur tunnettua, että ihmisen gastrointestinaalisen kanavan - se on olennaisesti bioreaktorissa virtauksen tyyppiä, jossa on useita mikro-organismeja elävät. Tutkijoiden suhtautuminen suolen mikroflooriin tänä aikana on muuttunut radikaalisti. Sata vuotta sitten, suuri Ilja Mechnikov, perustaja nykyaikaisen teorian immuniteetin luomiseksi, jonka hän sai Nobelin (kahdelle hänen leppymätön vastustaja, peräti suuri Paul Ehrlich), jopa ehdotti poistaminen paksusuolen keinona pidentää elämää. Ja ne, joita tämä toimenpide vaikutti liian radikaali, suositellaan juoda runsaasti jogurtti syrjäyttää haitallisia, hänen mielestään mikrobit hyödyllistä laktobasillien. Puolen vuosisadan aikana kurssi on muuttunut 180 astetta. Kävi ilmi, että normaali suoliston mikrobisto, sekä ihon ja limakalvojen suorittaa monia hyödyllisiä toimintoja - esimerkiksi tukahduttaa elintoimintoja elimistön jatkuvasti hyökkäävät taudinaiheuttajia. Ja viime vuosina, rohkein Mikrobiologien ovat menneet pidemmälle toteamalla henkilön ja symbioottinen mikrobeja yhden superorganismi.

Molekyylibiologian menetelmien kehittäminen on johtanut tutkijoille uudenlaista ymmärrystä ihmisen ja hänen mikroflooriprosessinsa prosesseista, jotka tuntuivat hyvin tutkitulta ja jatkotutkimukselta, josta he eivät odottaneet erityisiä yllätyksiä. DNA-sekvensointimenetelmien nopeuden ja kustannusten alentamisen nopea kasvu (sen nukleotidisekvenssin määrittäminen) ja henkilökohtaisen tietokoneen tehon ja Internetin kehittymisen rinnakkainen kasvu mahdollistivat suurien genomien osuuksien analysoinnin. Sen jälkeen, kun satoja yksittäisten bakteerien lajeja oli keksitty, mikro-organismien genetiikassa syntyi uusi lähestymistapa: populaatio-lähestymistapa: kaikkien bakteerien geenien analyysi, joka asui tietyllä alueella. Tietenkin "ihmisen bioreaktorin" väestö osoittautui olevan yksi tärkeimmistä mikrobiologisten populaatioiden tutkimiseen.

Ensimmäinen työ, joka teki täysin uuden näkökulman suolen mikrobiota, julkaistiin vuonna 1999 joukko tutkijoita National Research Institute of Agronomic Research (Ranska) ja University of Reading (UK). Kirjoittajat päättivät käyttää 16S RNA -geenien sekvensointimenetelmää mikrobien suoliston populaatioiden tutkimiseen (ks. Sivupalkki).

16S PHK - bakteerien tunnistaminen

Mikro-organismien määrityksen ensimmäinen vaihe on niiden viljely ravintoalustalla. Mikrobit eivät kuitenkaan halua kasvaa mihinkään mediaan

Modernit tekniikat
Tutkimus aiemmin saavuttamattomissa viljeltäväksi bakteerien ja alkaa asettaa tilaa täysin sekava taksonomian jo tunnettuja prokaryoottisten tuli mahdolliseksi kehittämisen kanssa bioinformatiikan ja tulo modernin molekyylibiologian - PCR mahdollistaa yhden DNA-alueen, vastaanottaa miljardeja jäljennöksiä, kloonaus valitun geenin bakteeriplasmidit ja sekvensointi-sekvenssejä, jotka menetelmät nukleotidit saatiin riittäviä määriä analysoitavaksi. Ihanteellinen markkeri mikro-organismien identifioimiseksi osoittautunut koodaavan geenin 16S ribosomaalisen RNA: n (kummankin ribosomaalisten alayksiköiden - työpajat solujen proteiinisynteesiä - muodostuu lomitettu ketjuja proteiinimolekyylien ja ribonukleiinihappojen).

Täydellinen merkki
Tämä geeni on genomissa kaikki tunnetut bakteerien ja arkkien, mutta puuttuu eukaryooteissa ja virukset, ja jos löydät hänen ominainen nukleotidisekvenssiä, - oletko varma tekemisissä geenit prokaryooteissa. Tällä geenillä on molemmat konservatiiviset kohdat, samoin kaikille prokaryooteille ja lajikohtaisesti. Yksinkertainen käyrät ovat tämän ensimmäisen vaiheen polymeraasiketjureaktion - lisäämällä kohde-DNA: ta alukkeiden (siemen DNA-osien, joihin tutkittu nukleotidiketjun pitäisi liittyä aloittaa analysoimalla muun sekvenssin) ja lajikohtaisten - lajien tunnistamiseen. Lajikohtaisten kohteiden samankaltaisuusaste heijastaa eri lajien evoluutiosuhdetta. Kloonaamista ja sen jälkeistä analyysiä varten voidaan käyttää itse ribosomaalista RNA: ta, joka on missä tahansa solussa läsnä suuremmassa määrin kuin vastaava geeni. Kaikkien tunnettujen bakteerien ja archaean 16S-RNA: n nukleotidisekvenssit ovat yleisesti saatavilla. Tunnistettuja sekvenssejä verrataan tietokantoihin löytyneisiin sekvensseihin ja tunnistetaan bakteerilajit tai julistetaan se kuuluvaksi kultivoimattomalle lajille.

Uusi systematiikka
Viime aikoina bakteerien vanha, fenotyyppinen luokittelu perustuu voimakkaasti virallisesti muotoutuneisiin kriteereihin - kolonioiden esiintymisestä ruoan mieltymyksiin ja kykyyn värjätä eri väriaineilla. Uusi järjestelmä perustuu molekyylikriteereihin (16S RNA) ja vain osittain toistaa fenotyyppisen.

Mitä meillä on sisällä

Koodaussekvenssit 16S RNA: n polymeraasiketjureaktio (PCR) poistettiin suoraan "ympäristö" - 125 mg ihmisen, valitettavasti ulosteesta insertoitiin E. coli-plasmidi (ei, koska se suolen, ja koska Escherichia coli - yksi molekyylibiologien suosituista työhevosista) ja eristetty uudelleen moninkertaistettujen bakteerien viljelmästä. Siten luotiin 16S RNA -geenien kirjasto kaikille näytteen mikro-organismeille. Tämän jälkeen 284 kloonia valittiin satunnaisesti ja sekvensoitiin. Kävi ilmi, että vain 24% tuloksena olevista 16S-RNA-sekvensseistä kuului aikaisemmin tunnetuille mikro-organismeille. Kolme neljäsosaa mikroflooran sijaitsee suolistossa jokaisen ihmisen, yli sata vuotta välttänyt huomiota tutkijoiden, aseistettu menetelmiä klassisen mikrobiologian! Tutkijat yksinkertaisesti ei löytänyt ehtoja viljelemiseen näille bakteereille, koska kaikkein oikukas asukkaat suolen kieltäytyi nousta perinteisen mikrobien ympäristöissä.

Tähän mennessä on käytetty molekyylien menetelmien mukaan 10: sta 70: stä suuresta bakteeriperäisestä taksosta aikuisen mikrobiotissa. Noin 90% mikrobeista kuuluvat firmicutes tyyppi (tämä sisältää esimerkiksi kuuluisa maitohappobakteerit - tärkein "syyllisiä" souring maito) ja Bacteroidetes - velvoittaa anaerobeja (organismeja, jotka voivat elää vain ilman happea), joita usein käytetään indikaattorina saasteiden luonnollinen jäteveden. Loput 10% väestöstä jaettu taksonikoostumus proteobakteerien (näitä ovat muun muassa E. coli), Actinobacteria (yhdestä aktinomykeettilajia antibiootti streptomysiiniä eristettiin), Fusobacteria (normaali asukasta suuontelon ja aiheuttavat usein parodontiitti), Verrucomicrobia (äskettäin geoterminen lähde havaittiin muodossa mikrobeja, jotka syövät metaania, joka on runsaasti suolistossa, koska muita mikro-organismeja), syanobakteerit (ne ovat edelleen usein kutsutaan vanha - "sini-vihreä levät»), -spirokeettojen (onneksi ND, ei kalpea), Synergistes ja VadinBE97 (millaisia ​​eläimiä, pyydä luovat uuden taksonomian prokaryootit).

Mikrobia meissä enemmän kuin ihminen

Tätä tarkoitusta varten, kaikkein automatisoitu, tietokoneistettu ja korkean suorituskyvyn DNA-sekvensoinnin tekniikka, joka antaa mahdollisuuden analysoida lyhyt nukleotidisekvenssin, koota palapeli useita päällekkäin "kirjaimet" päissä näistä alueista toistuvasti toistaa tämä menettely jokaisen palan genomin ja vastaanottaa transkriptien yksittäisten geenien ja kromosomien kanssa jopa 14 miljoonaa nukleotidin tunnissa - useita kertaluokkia nopeammin kuin teimme muutama vuosi sitten. Näin ollen havaittiin, että suoliston mikrobiston on noin 100000000000000 bakteerisolut - noin kymmenen kertaa enemmän kuin kokonaismäärä ihmisen kehon solujen.

Bakteeri-metagenomeja muodostavien geenien joukko on noin sata kertaa suurempi kuin ihmiskehon geenien joukko. Jos puhumme mikrobipopulaatiossa esiintyvien biokemiallisten reaktioiden määrästä, se toistuvasti ylittää biokemiallisten reaktioiden määrän ihmiskehossa.

Bakteerien "reaktori" työkoneita isännässä aineenvaihdunnan ketju, joka, joka ei kykene tukemaan itseään - esimerkiksi synteesi vitamiinien ja niiden esiasteita, hajoaminen noin toksiinien, hajoaminen selluloosan sulavat polysakkaridit (märehtijöissä), jne...

Lapsuudesta vanhuuteen

Huolimatta siitä, että suolen mikro-organismien lajikoostumus on melko monotoninen, tiettyjen systemaattisten ryhmien edustajien määrällinen suhde eri ihmisten mikrobiotissa voi vaihdella suuresti. Mutta mikä on normaali suolen mikrofluora ja mitkä ovat sen muodostumiskeinot?

Tämä kysymys vastasi vuoden 2007 työhön amerikkalaisten biologien ryhmästä, jota johti Patrick Brown Stanfordin yliopistosta. Ne jäljittivät mikrobiotteen muodostumista 14 vastasyntyneelle ensimmäisen elinvuoden aikana. Kirjoittajat onnistuivat luomaan useita lähteitä ruoansulatuskanavan kolonisaatiosta. Vauvojen mikrobiotit olivat samanlaisia ​​kuin äidin mikrofloora: emättimen, ulosteiden tai mikrofloranäytteet rintamaidosta. Riippuen lähteistä siirtokuntien suoliston mikrobisto imeväisten ensimmäisen elinvuoden hallitsi eri lajia. Nämä erot pysyivät merkittävinä koko tutkimusjakson ajan, mutta vuoden ikäisenä näkyi aikuisen mikrobiotin muodostumisen piirteet. Mielenkiintoisia tietoja saatiin käyttämällä kaksoisparia. Niiden mikrofloora oli koostumukseltaan käytännöllisesti katsoen identtinen ja vaihteli samalla tavalla. Tämä havainto paljasti "mikrobiota-isäntäparin" ihmisen komponentin valtavan roolin suolen mikroflooripopulaation muodostumisessa. Puhtaudesta kokeilu tietenkin oltava erillinen vauvoja vielä sairaalassa (muuten, ihana tarina Intian elokuva! Vuosia myöhemmin, kaksoset tutustuvat toisiinsa analyysiin mikroflooran.). Muiden tutkimusten tulokset kuitenkin vahvistavat oletuksen, että ihmisen biokemian yksilölliset, mukaan lukien hereditarilyolosuhteet, vaikuttavat merkittävästi mikrobiotin koostumukseen.

Ohut ja paksu

Tutkimuksissa laboratoriossa Jeffrey Gordon (School of Medicine Washington Universityssä, St. Louis, MO), yhdistää monimuotoisuutta bakteerien ruoansulatuskanavan ruokavalion ja yksilön ominaisuuksista aineenvaihduntaa. Kokeelliset tulokset julkaistaan ​​joulukuun numerossa lehden luonto vuodelle 2006. Vuosikokeessa ehdotettiin ihmisen ylimäärän ja hänen suolistansa mikrobipopulaation koostumuksen välisen korrelaation määrittämistä. Kymmeniä rasvoja, jotka suostuivat asettamaan kynnet tieteen alttarille, jaettiin kahteen ryhmään. Yksi kylä ruokavaliolla vähärasvainen, toinen - matala hiilihydraattipitoisuus. Kaikki vapaaehtoiset menettäneet painonsa ja samalla muuttivat suolen mikro-organismien kahden pääryhmän suhdetta: Firmicutes-solujen määrä väheni ja Bacteroidetes-luku kasvoi päinvastoin. Alhainen rasvaa sisältävä ruokavalio muuttui myöhemmin havaittavaksi - kun potilaat menettivät 6% painosta ja vähärasvaisen ruokavaliota - menettivät ensimmäiset kilogrammansa (2% alkuperäisestä painosta). Muutos koostumuksessa mikroflooran oli selvempi pienemmän kertoimen tuli osallistujat kokeiluun.

Taistelu lihavuudesta

Tulokset lisätutkimuksia tiedemiesten muuttaa hiiren-symbioottinen mikrobiorganismin (ks. Laatikko "testattu hiirillä") loistavasti vahvisti olettamuksen, että mikrobiston lihavia yksilöitä parantaa syvä käsittely ruokaa. Lihavien ja normaalien hiirien ulosteiden DNA-näytteiden vertailu osoitti, että lihavien hiirien hiiret kyllästyvät entsyymigeeneillä, jotka sallivat polysakkaridien tehokkaamman hajoamisen. Suoli lihavilla hiirillä sisälsi suuren määrän käymisen lopulla tuotteet - yhdisteitä etikkahapon ja voihapon, joka osoittaa tarkempi käsittely ruoka-aineksiin. Calorimeter (! Valitse sana "kaloreita") Näytteiden analysointi vahvisti, että hiiren Puhetta tuoli ob / ob-hiirestä sisälsivät vähemmän kaloreita kuin villin tyypin hiirillä, jotka eivät olleet täysin rinnastaa energiaa ravinnosta.

Sen lisäksi, että tärkeitä tietoja "alkio" osa lihavuuden kirjoittajat pystyivät osoittamaan perustavanlaatuisia samankaltaisuus mikrobikasvustoon lihavia ihmisillä ja hiirillä, mikä avaa uusia näkökulmia ongelman tutkimukset ylipainoa ja mahdollisesti ratkaista tämän ongelman "siirto" terve mikrobisto tai sen muodostumista potilailla kärsivät lihavuudesta.

Testattu hiirillä

Ja uupumalla

Mikrobiotin hallitseminen isännän aineenvaihdunnassa ei enää ole epäilystäkään. Gordonin laboratorion tutkimus, jossa käsiteltiin liiallista painoa, mahdollisti sillan siirtymisen metabolisen sairauden hoitoon. Heistä on sellaisia ​​yleisiä ehtymistyyppejä, jotka vaikuttavat 1-4-vuotiaisiin köyhissä maissa, joissa on trooppinen ilmasto, kuten marasmus (marasmus). Tämä sana on vain kielen suhde: kreikka. marasmoz kirjaimellisesti tarkoittaa loppua, sukupuuttoa) ja kwashiorkor (jonkin Ghanin heimon kielellä kvašiorkor - "punainen poika"). Sellaisten tautien esiintyminen liittyy puute proteiineja ja vitamiineja siirryttäessä imetyksen aikuisten ruokaa. Mutta taudit selektiivisesti vaikuttavat lapsiin, joiden veljet ja sisaret eivät kokeneet mitään ongelmia siirtymällä perinteiseen ruokavalioon alueelle. Tutkimukset ovat osoittaneet, että suoliston mikrofloora sairaiden lasten on hyvin erilainen kuin mikrofloorasta vanhempiensa, samoin kuin mikrobisto terveiden sisarusten. Ennen kaikkea on huomattava lähes täydellinen puuttuminen suoliston populaatioiden Bacteroidetes ja ylivaltaa harvinaisten lajien kuuluvien tyypit proteobakteerien ja Fusobacteria. Jälkeen sairaita lapsia (varo yliannostuksen!) Lihotetaan kovan proteiini ruokaa, niiden mikrobisto muuttuu lähellä normaalia, kuten sukulaisia, joista suurin osa on Bacteroidetes ja firmicutes.

Viimeaikaiset tutkimukset paitsi radikaalisti muuttanut vallitsevan käsitteet ihmisen suoliston mikrobisto, mutta myös osaltaan syntymistä käsite, joka pitää suolistomikrobistoon ylimääräisenä monisoluisten "body" ihmisen. Eri solulinjoista koostuva elin, joka kykenee kommunikoimaan keskenään samoin kuin isäntäorganismin kanssa. Elimistö, joka jakaa energiavirtoja, toteuttaa tärkeitä fysiologisia reaktioita, muuttaa ympäristön vaikutuksia ja palauttaa itsensä takaisin ulkoisten olosuhteiden aiheuttamilla muutoksilla. Jatkuvan tutkimuksen "bakteeri elin" voi ja sen pitäisi johtaa ymmärrystä lakeja sen toimintaa, paljastaminen hänen herkkä suhteita isännän ja tämän seurauksena, uusien menetelmien torjumiseksi ihmisen sairauksien kohdennetulla dysfunktioiden kahden komponentin metaorganizma.

16S-RNA: n analyysi

Ribosomaaliset ribonukleiinihapot (rRNA) - useita RNA-molekyylejä, jotka muodostavat ribosomin perustan. RRNA: n päätoiminto on mRNA: n informaation kääntämisen prosessin toteutus mukauttamalla tRNA-molekyylejä ja katalysoimalla peptidisidosten muodostumista tRNA: n liitteenä olevien aminohappojen välille.

pitoisuus

Ribosomaaliset osaerät ja rRNA: n nimikkeistö

Erottamattomien ribosomien elektronimikroskooppisissa kuvissa on havaittavissa, että ne koostuvat kahdesta eri koosta koostuvasta osapartikkelista.

Subpartikkelien massojen suhde on

2: 1; massa, puolestaan, ilmaistuna vakioita mitattu suoraan sedimentaatio (laskeutumisnopeus on Svedberg yksikköä, S), ultratsentrifugovanii, ja se on tämä parametri on perustana nimikkeistön rRNA ja ribosomit ja ribosomaalisen alayksiköt: tyyppi käytettävien nimitysten

Esimerkiksi ribosomaalinen prokaryoottinen RNA, jonka sedimentaatiokerroin on 16 Svedberg-yksikköä, merkitään 16S rRNA: ksi.

Koska sedimentoitumiskertoimet eivät riipu ainoastaan ​​molekyylimassasta vaan myös hiukkasten muodosta, dissosiaation sedimentaatiokertoimet eivät ole lisäaineita: esimerkiksi bakteeriperäisiä ribosomeja, joilla on molekyylimassa

3 * 10 6 Daltonin sedimentaatiokerroin on 70S, merkitty 70S: ksi ja disossoituu 50S: n ja 30S: n alayksiköiksi:

Ribosomaaliset hiukkaspartikkelit sisältävät yhden suuren pituisen rRNA-molekyylin, jonka massa on

1/2 - 2/3 ribosomaalisen subpartikkelin massasta, joten bakteeriperäisten ribosomien 70S tapauksessa 50S-osa-osa sisältää 23S rRNA: n (pituus

3000 nukleotidia) ja 30S-osa-osa sisältää 16S rRNA: n (pituus

1500 nukleotidia); suuri ribosomialayksikkökoettimella lukuun ottamatta "pitkä" rRNA myös sisältää yhden tai kaksi "lyhyttä" rRNA (5S rRNA bakteeri- ribosomin 50S-alayksiköt tai 5S ja 5,8 S rRNA bolshii eukaryoottinen ribosomaalinen alayksiköitä).

synteesi

Ribosomaalisen RNA: n osuus on suuri (jopa 80%) kokonais-solu-RNA: sta, tällainen rRNA: n määrä vaatii sen koodaavan geenin intensiivistä transkriptiota. Tämä voimakkuus tarjoaa runsaasti kopioita rRNA: ta koodaavista geeneistä: eukaryootteissa on useita satoja (

200 hiivaa) kymmeniin tuhansiin (eri puuvillalinjojen mukaan 50-120 tuhatta kopiota) geeneistä, jotka järjestettiin tandem-toistoiksi.

Ihmisillä rRNA: ta koodaavat geenit järjestetään myös ryhmiin tandem repeatteihin, jotka sijaitsevat lyhyiden varsien 13, 14, 15, 21 ja 22 kromosomien keskialueilla.

Niitä syntetisoidaan RNA-polymeraasi I: llä pitkään pre-ribosomaalisen RNA: n molekyylinä, joka leikataan yksittäisiin RNA: iin, jotka muodostavat ribosomien perustan. Bakteereissa ja arkeassa alkuperäinen transkripti sisältää yleensä 16S, 23S ja 5S rRNA: n, joiden välissä esi-rRNA-sekvenssit poistetaan käsittelyn aikana. Tavallisesti yksi tai useampia tRNA-geenejä sijaitsee 16S- ja 23S-rRNA-geenien välillä; Siten E. colissa tällaisen geeniryhmän alkukirjoitus on seuraava:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Tällainen transkripti jakautuu pre-rRNA: n ja tRNA: n fragmentteihin ribonukleaasi III: n avulla.

Eukaryootteissa 18S, 5.8S ja 25/28 rRNA: t koproidaan RNA-polymeraasi I: llä, kun taas 5S rRNA-geeni transkriboituu RNA-polymeraasi III: lla.

Eukaryooteissa, geenien pitoisuus tila koodaus rRNA, yleensä selvästi solun tumassa, kertymisestä johtuvaa noin alayksiköiden ribosomien, jotka ovat koottavia tapahtuu välittömästi. Nämä klusterit hyvin värjättiin sytologisten väriaineet ja ne tunnetaan tuma. Näin ollen, kun läsnä on nucleoli ei ole spesifinen kaikille solusyklivaiheista: jako solun tuman profaasissa dissosioituu koska rRNA synteesi ja suspendoitiin uudelleen lopussa telophase muodostuu, kun jatkamista rRNA synteesi.

Pro- ja eukaryootti-rRNA: n vertaileva analyysi

Ribosomaalista RNA: ta (kuten ribosomin) prokaryooteissa ja eukaryooteissa eroavat toisistaan, vaikka osoittavat merkittävää sekvenssin samankaltaisuutta osia. Prokaryootti-70S ribosomi käsittää suuren 50S-alayksikön (muodostettiin kaksi molekyyliä rRNA - 5S ja 23S) ja 30S pienen alayksikön (rakennettu perusteella 16S rRNA). 80S eukaryoottisen ribosomin muodostuu suuri 60S-alayksikön (rakennettu pohjalta kolmen molekyylin rRNA - 5S, 5,8S ja 28S) ja 40S pienen alayksikön (rakennettu perusteella 18S rRNA).

Sekvenssitietojen käyttö

Tietoja tietyn organismin rRNA: sta käytetään lääketieteessä ja evoluutiobiologiassa.

  • RRNA-geeni on yksi konservatiivisimmista (vähiten muuttuvista) geeneistä. Siksi organismin systemaattinen asema ja eron aika suhteessa siihen liittyviin lajeihin voidaan määrittää rRNA-sekvenssien yhtäläisyyksien ja erojen analyysin perusteella.
  • rRNA on tavoite useita antibiootteja, joista osa on kliinisessä käytössä, sekä estämään bakteerien kasvua (antibiootit, prokaryoottiset ribosomia sitova) ja hoitoon ihmisen sairauden (antibiootit sitoutuvat eukaryoottisen ribosomin). Ensimmäinen ryhmä sisältää kloramfenikoli, erytromysiini, kasugamysiini, mikrokokksin, spektinomysiini, streptomysiini, tiostreptonia. Toiseen hygromysiini B: hen, paromomysiini.

Aiheeseen Liittyviä Artikkeleita Hepatiitti